Kurzbeschreibung:
Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction = PCR) erlaubt es, aus geringsten Mengen Ausgangs-DNA spezifische DNA-Fragmente von ca. 500 - 1000 Bp Länge zu synthetisieren (amplifizieren). PCR-Produkte können dann z.B. in einem Agarose-Gel nachgewiesen werden, oder mit anderen Methoden weiterverarbeitet werden. Die Basis der PCR-Reaktion bildet die hitzeresistente Taq-Polymerase, die zu einem DNA-Einzelstrang den entsprechenden Gegenstrang synthetisiert. Die Tatsache, dass die Synthese nur an Abschnitten mit Doppelstrang-DNA beginnen kann, wird dazu benutzt, durch Wahl enstprechender Oligonucleotide (Primer), je einen auf jedem DNA-Strang, das zu amplifizierende DNA-Fragment zu definieren. Das DNA-Fragment wird exponentiell vermehrt, indem in 25-30 Zyklen je 3 Temperaturstufen durchlaufen werden. Bei 95°C denaturiert die DNA zu Einzelsträngen. Bei 55-68° lagern sich die beiden Oligonucleotiode (Primer) spezifisch an den DNA-Einzelstrang an (Annealing) und ermöglichen dadurch den Beginn der Taq-Polymerase-Reaktion. Bei 72°C wird der Gegenstrang synthetisiert (Extention).
Bei der RT-PCR können spezifische RNA-Sequenzen nachgewiesen werden, indem die RNA zuerst mit Hilfe der "reverse transcriptase" (RT) zu cDNA umgewandelt und dann mittels normaler PCR amplifiziert wird.
Bei der quantitativen Real-time PCR wird bei jedem Synthesezyklus ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiertes Nucleotid freigesetzt. Dadurch kann das entstehende DNA-Fragment direkt im PCR-Gerät verlässlich und exakt quantifiziert werden.
Indikation:
PCR-Methoden finden bei hämatologischen Krankheiten viele Einsatzmöglichkeiten. Hier werden nur einige illustrative Beispiele aufgezählt: